对于成功的BNCT方法，肿瘤中应积累足够的硼10原子，并且通过热中子辐照诱导其细胞毒性的功效需要进一步提高。BNCT的功效依赖于相对高的量的递送硼10原子至靶细胞;据估计，每克肿瘤必须递送约30μg的硼10原子，以维持致命的肿瘤细胞损伤。因此，已经基于靶向方法开发了第三代递送系统，包括缀合肿瘤受体特异性抗体或配体以进行主动靶向以及使用高分子量递送剂，例如碳纳米管，脂质体，胶束，树枝状大分子和其他人造纳米粒子，形成主动和被动靶向的受体配体。因此，已经广泛开发了第三代递送系统，尤其是针对靶向细胞质膜的癌症受体。但是，细胞内靶向，例如靶向细胞器，很少用于BNCT研究。当由BNCT引起的细胞器损伤诱导细胞死亡时，细胞死亡的效率和途径可能受到受损的细胞器的影响。在这里，硼中子研究网旨在利用细胞穿透肽开发BNCT技术15增强了硼化合物的细胞摄取及其在细胞内的受控定位。硼中子研究网评估了硼化合物在其受控的细胞内位置对BNCT后生物学活性的影响。

在这项研究中，硼中子研究网设计并合成了靶向细胞器的肽共轭硼簇，以增加其细胞摄取并控制其细胞内位置，从而在BNCT下诱导复杂的癌细胞杀伤活性。硼中子研究网采用了三种类型的CPP，以增强细胞对硼化合物的摄取，细胞膜渗透和受控的细胞内定位。八-精氨酸是典型的富含精氨酸的CPP。CPP被各种类型的单元通过内吞途径，特别是通过巨胞吞作用，以及通过内体逃逸或直接质膜穿透而使肽类细胞质释放。在这项研究中，硼中子研究网使用R8的D对映体防止肽水解酶消化肽。对于线粒体靶向，硼中子研究网以前开发质膜渗透的，线粒体靶向肽和RLA。使用KLA的D-对映体。因为精氨酸残基在肽序列在细胞膜渗透性发挥关键作用所述的CPP的，的取代D赖氨酸在KLA用肽D-精氨酸产生具有高线粒体靶向能力和高质膜渗透性的新型载体肽。由于细菌和线粒体膜之间的相似性，已将20种抗菌肽用作凋亡诱导剂。线粒体内部具有负电压，并且抗菌肽可能以电压依赖性方式与线粒体膜相互作用。如“材料和方法”部分中所述，所有肽的化学合成都是通过Fmoc固相肽合成进行的。羧基十二硼酸盐衍生物将N-末端的CPP的COOH被进行，以便完成缀合。

首先，硼中子研究网使用共聚焦激光显微镜检查了CPP共轭对十二硼酸盐的细胞摄取，胞质释放和细胞内定位的影响。在含有D-MEM的D-MEM中，将C6胶质瘤细胞在37°C下用与RLA肽偶联的荧光标记的十二硼酸酯处理30分钟。共聚焦激光显微镜观察前10％的胎牛血清。在DB-RLA的情况下，样品被细胞摄取后，观察到荧光带状线粒体结构，并且未确认到内体样点信号。另一方面，在DB-r8的情况下，可以观察到内体样点和胞质荧光信号。使用抗十二碳酸酯抗体，硼中子研究网还检查了无荧光标记的CPP缀合的十二碳酸酯的细胞摄取。在细胞固定之前，将C6胶质瘤细胞在10％含FBS的D-MEM中在37°C下用CPP结合的十二硼酸酯处理30分钟，然后进行细胞固定，抗十二硼酸酯抗体的细胞染色和共聚焦激光显微镜观察。即使在使用抗体的实验中，也可以观察到DB-RLA的线粒体积累和DB-r8的胞质释放。DB-RLA的荧光信号与线粒体染色共定位。在DB-r8的情况下，即使在胞浆中存在荧光信号，也观察到与MitoTracker染色缺乏共定位的现象。显示了通过酶联免疫吸附测定分析的C6神经胶质瘤细胞对内在硼的定量分析。在与图S3a所示的相似的细胞摄取条件下，与没有CPP缀合的BSH相比，RLA肽共降解的结合使细胞摄取增加了约4倍。缀合为十二酸酯的RLA肽也增加了细胞摄取功效。然而，与r8肽的缀合降低了细胞的十二硼酸盐摄取。基本上，寡精氨酸肽的细胞摄取功效显示出S型增加，这取决于肽的浓度。带负电荷的硼化合物与r8肽的结合可能会影响乙状细胞摄取的增加，导致硼化合物的细胞摄取效率低下，尽管应进一步研究详细的原因。对于BSH，细胞摄取BSH后，可通过共聚焦激光显微镜观察到内体样荧光点信号和与质膜的结合，表明每个CPP的共轭共分解都可以极大地控制硼化合物在细胞吸收后的细胞内位置。C6胶质瘤细胞的存活率没有受到影响，如在用每种CPP缀合的十二硼酸盐处理后通过WST-1分析进行分析。

硼中子研究网还检查了DB-RLA肽在细胞摄取后对线粒体的保留。将C6胶质瘤细胞在37°C下用DB-RLA处理30分钟后，洗涤细胞以去除未被细胞吸收的肽，然后用新鲜的细胞培养基处理细胞在37°C下放置24小时。使用共聚焦激光显微镜观察表明，即使将细胞在无肽培养基中孵育24小时后，线粒体也能强烈保留DB-RLA。显示了主要观察到的荧光带状线粒体结构。相反，在DB-r8的情况下，在肽处理后可以观察到肽的胞质释放；然而，在细胞洗涤并在新鲜细胞培养基中于37°C孵育24小时后，仅观察到非常弱的内体样荧光点信号。这些结果表明，RLA肽具有很强的能力，可以在细胞膜穿透和线粒体积累后保留其在线粒体中的定位。

接下来，硼中子研究网检查了每种CPP-十二硼酸酯结合物对热中子辐照的影响及其通过BNCT杀灭细胞的活性。将C6胶质瘤细胞在10％含FBS的D-MEM中于37°C下用CPP结合的十二硼酸酯处理30分钟后，在室温下用热中子照射细胞90分钟。如材料和方法部分中所述，通过集落分析评估细胞活力7天。在BSH的情况下，高浓度的BSH显示出较弱的细胞杀伤活性。较低浓度的DB-r8表现出与BSH相似的杀细胞活性。DB-RLA处理与其他CPP缀合的十溴酸盐相比具有高的细胞杀伤活性。这些发现表明，将CPPs结合到十分解代谢物上可增强其细胞膜渗透性和胞质定位，特别是在将RLA肽用于线粒体积累时，可通过热中子辐照有效地提高十二分解代谢物的细胞杀伤活性。

为了了解为什么DB-RLA的治疗在热中子辐照后显示很好的细胞杀伤活性，硼中子研究网评估了细胞死亡途径。图S6a显示了在37°C下在含10％FBS的D-MEM中对每种十二水合物处理30分钟后，C6胶质瘤细胞中的胱天蛋白酶3/7活性。胱天蛋白酶3和7是细胞凋亡的指示剂，并且用BSH和热中子辐射处理并未增加胱天蛋白酶3的活性。另一方面，BSH，DB-r8和DB-RLA的每种处理均类似地增加了caspase3/7活性，尽管DB-与热中子辐照后的其他样品相比，RLA具有高的细胞杀伤活性。硼中子研究网还检测了早期细胞凋亡中质膜上磷脂酰丝氨酸的含量。图S7显示了使用FITC标记的膜联蛋白V检测C6胶质瘤细胞膜上的PS，以及对BSH，DB-r8和DB-RLA的处理同样在热中子辐照后增加了质膜上结合的FITC标记的膜联蛋白V的荧光强度。硼中子研究网还评估了C6胶质瘤细胞中5'-三磷酸腺苷的含量，因为线粒体在细胞能量代谢中起着基本作用，并且是ATP的主要产生者，这对于维持细胞体内稳态非常重要。DB-r8显着降低了细胞ATP含量，用DB-RLA处理后，ATP含量进一步降低。这些结果表明，RLA肽可以通过细胞膜从细胞外部将十二硼酸转移至线粒体，导致热中子辐照后ATP含量降低和有效的细胞杀伤活性。ATP含量降低可能是细胞杀伤活性的关键因素之一。但是，需要进一步的实验来阐明详细的机制。据报道，硼化合物处理和热中子辐照引起的细胞凋亡具有增加的细胞凋亡标记。蛋白质组学分析表明，内质网中的蛋白质功能，DNA修复和RNA加工通过热中子辐照导致显着变化。硼化合物处理和热中子辐照诱导坏死的报道也有报道，但是BNCT中坏死诱导的详细机制仍然未知。在这项研究中，DB-RLA的处理显示出比DB-r8的ATP含量进一步降低，并且在DB-RLA和DB-r8的处理中证实了类似水平的caspase3/7活性。ATP耗竭诱导坏死，表明坏死不需要细胞内ATP。由于已经报道了阻止线粒体ATP产生的线粒体膜电位的丧失是凋亡的早期步骤，因此必须通过糖酵解来提供其余细胞凋亡过程所需的细胞内ATP。BNCT中的DB-RLA可能会增强坏死，应研究详细的机制。

在这项研究中，硼中子研究网使用CPP实现了十二烷基酸酯的局部细胞内递送，并发现由于特定的细胞杀伤途径，这种在细胞内的受控递送对于有效诱导BNCT的细胞杀伤活性非常重要。硼中子研究网的发现不仅将有助于BNCT的发展，而且还将有助于其他治疗技术的发展。硼中子研究网强调了以细胞器为目标的系统对实现治疗分子的复杂生物学活性的重要性。

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